Afinitní chromatografie v medicíně: vlastnosti a aplikace

Chromatografie je jednou z metod separace látek. Používá se pro následnou kvalitativní a kvantitativní analýzu fyzikálních a chemických vlastností mikročástic. Typ této technologie je afinitní chromatografie. Myšlenka diferenciace proteinových sloučenin pomocí vlastnosti afinity molekul je ve vědě známa již několik desetiletí. Svůj vývoj však získala až v posledních letech, po zavedení vysoce porézních hydrofilních materiálů používaných jako matrice. Tato metoda umožňuje řešit jak analytické problémy (separace látek a jejich identifikace), tak preparativní (čištění,koncentrace) .

Entita

Afinitní chromatografie (z latinského slova affinis - "sousední"," příbuzný") je založena na afinitních interakcích, což je tvorba vysoce specifických vazeb mezi oddělovací molekulou (ligandem nebo afinitou) a cílovou molekulou. Tyto mechanismy jsou v přírodě rozšířené (vazba mediátorů nebo hormonů a receptorů, protilátek a antigenů, hybridizace polynukleotidů a další typy procesů). V medicíně se afinitní chromatografie začala používat pro praktické účely počínaje rokem 1951.

Rozdělení komponent je následující:

• pracovní roztok obsahující látku, která má být izolována, prochází sorbentem;
• ligand nanesený na matrici-sorbent drží tuto látku;
• dochází k jeho koncentraci (akumulaci);
• extrahování izolované látky ze sorbentu pomocí vyluhování rozpouštědlem.

Tato metoda umožňuje zvýraznit celé buňky. Rozdíl od tradiční sorpční chromatografie je, že existuje silná biospecifická vazba vylučované složky na sorbent, charakterizovaná vysokou selektivitou.

Adsorbent

Jako adsorbenty se používají následující látky:

• Gelové formulace na bázi agarózy-polysacharidu získaného z agaru. Nejčastěji se používají 3 odrůdy: sepharosa 4 v, CL (zesítěná agaróza) a Affi gel. Poslední formulací je modifikovaný gel vyrobený z agarózy a polyakrylamidu. Má větší biologickou setrvačnost, vysokou chemickou a tepelnou odolnost.
• Oxid křemičitý (silikagel).
• Sklo.
• Organické polymery.

K odstranění mechanických překážek při kontaktu ligandu se používají další látky, které jej oddělují od nosiče (peptidy, diaminy, polyaminy, oligosacharidy).

Aparatura

Zařízení pro afinitní chromatografii obsahuje následující hlavní uzly:

• úložné kapacity pro mobilní fázi (eluent);
• vysokotlaké čerpadlo pro podání média (nejčastěji pístová);
• filtr pro čištění eluentů od prachu;
• dávkovací zařízení;
• chromatografická kolona pro separaci směsi;
• detektor pro identifikaci oddělených komponent vycházejících ze sloupce;
• záznamníky chromatogramu a mikroprocesorová jednotka (počítač).

Aby se snížilo množství rozpuštěného vzduchu, je hélium předáno mobilní fází. Pro změnu koncentrace eluentu je instalováno několik čerpadel řízených programátorem. Chromatografické kolony jsou vyrobeny z nerezové oceli( se zvýšenými požadavky na odolnost proti korozi), skla (univerzální verze) nebo akrylu. Pro preparativní účely se jejich průměr může pohybovat od 2 do 70 cm. V analytické chromatografii se používají Mikrokolony Ø10-150 µm.

Pro zvýšení citlivosti detektorů se do směsi zavádějí činidla, která podporují tvorbu látek, které více absorbují paprsky v ultrafialové nebo viditelné oblasti spektra.

Metodika provádění

Existují 2 hlavní typy kapalinové afinitní chromatografie:

• Sloupec, ve kterém je sloupec naplněn stacionární fází a prochází směsí s proudem eluentu. K oddělení může dojít pod tlakem nebo pod vlivem gravitace.
• Tenkovrstvá. Eluent se pohybuje po ploché vrstvě adsorbentu pod vlivem kapilárních sil. Adsorbent se nanáší na skleněnou desku, keramickou nebo křemennou tyčinku, kovovou fólii.

Základní fáze práce zahrnují:

• příprava adsorbentu, fixace ligandu na nosiči;
• dodávka separační směsi do chromatografické kolony;
• zatížení mobilní fáze, vazba složky ligandem;
• fázová substituce pro izolaci vázané látky.

Jmenování

Afinitní chromatografie se používá k izolaci následujících druhů látek (v závorkách je uveden typ ligandu použitého v tomto případě):

• analogy enzymatických inhibitorů, substrátů a kofaktorů (enzymy);
• bioorganické látky, které vykazují známky genetické cizoložství, viry a buňky (protilátky);
• sacharidy s vysokou molekulovou hmotností, monosacharidové polymery, glykoproteiny (lektiny);
• jaderné proteiny, nukleotidyltransferázy (nukleové kyseliny);
• receptory, transportní proteiny (vitamíny, hormony) ;
• proteiny interagující s buněčnými membránami (buňky).

Tato technologie se také používá k výrobě imobilizovaných enzymů a jejich navázání na celulózu umožňuje výrobu imunosorbentů.

Chromatografie proteinů vázajících DNA

Izolace proteinů vázajících DNA se provádí pomocí heparinu. Tento glykosaminoglykan je schopen vázat velký rozsah molekul. Afinitní chromatografie proteinů této skupiny se používá k izolaci látek, jako jsou:

• translační iniciační a elongační faktory (syntéza molekul nukleových kyselin a proteinů);
• restriktázy (enzymy rozpoznávající určité sekvence ve dvouvláknové DNA);
• Dna ligázy a polymerázy (enzymy katalyzující spojení dvou molekul za vzniku nové chemické vazby a podílející se na replikaci DNA);
• inhibitory serinových proteáz, které hrají důležitou roli v imunitních a zánětlivých procesech;
• růstové faktory: fibroblasty, Schwanna, endoteliální;
• proteiny mezibuněčné matrice;
• hormonální receptory;
• lipoproteiny.

Důstojnost

Tato metoda je jednou z nejkonkrétnějších pro izolaci reaktivních sloučenin (enzymy a větší agregáty-viry). Používá se však nejen k izolaci biologicky aktivních látek.

Detekce protilátek v malém množství, kvantifikace kyseliny polyadenylové, rychlé stanovení molekulových hmotností dehydrogenáz, odstranění určitých znečišťujících látek, studium kinetiky aktivace neaktivní formy trypsinu, molekulární struktury lidských interferonů-to není celý seznam studií, při kterém používá se afinitní chromatografie. Použití na klinice je způsobeno takovými výhodami, jako jsou:

• Možnost účinného čištění proteinů, polysacharidů, nukleových kyselin. Mírně se liší svými fyzikálně-chemickými vlastnostmi a ztrácejí aktivitu při hydrolýze, denaturaci a dalších druzích expozice používaných v jiných metodách.
• Rychlost separace látek, dynamická povaha procesu.
• Není nutné speciální čištění enzymů a homogenizace izoenzymů pro stanovení disociačních konstant.
• Schopnost oddělit širokou škálu látek.
• Malá spotřeba ligandů.
• Možnost separace látek ve velkých objemech.
• Reverzibilní proces vazby biologických makromolekul.

Tuto techniku lze kombinovat s ostatními, aplikovat další pole (gravitační, elektromagnetické). To umožňuje rozšířit technické možnosti chromatografie.

Enzymové inženýrství

Díky této metodě začal aktivní rozvoj nového odvětví biotechnologií-enzymového inženýrství.

Afinitní chromatografie aplikovaná na uvolňování enzymů má následující výhody:

• získání enzymů ve velkém množství v důsledku nižších nákladů na čas – jako výsledek-jejich snížení nákladů;
• imobilizace enzymů umožňuje výrazně rozšířit rozsah jejich použití v medicíně a průmyslu;
• spojení enzymů s nerozpustným pevným substrátem poskytuje příležitost studovat vliv mikroprostředí a směr reakcí, které hrají důležitou roli v přírodních a fyziologických procesech.