Rekombinantní dna: popis, charakteristiky

Rekombinantní DNA jsou molekuly tvořené laboratorními technikami genetické rekombinace, které kombinují genetický materiál z více zdrojů. Je to možné, protože molekuly DNA všech organismů mají stejnou chemickou strukturu a liší se pouze nukleotidovou sekvencí v jejích mezích.

Vytvoření

Molekulární klonování je laboratorní proces používaný k vytvoření rekombinantní DNA. Je to jedna ze dvou nejpoužívanějších metod spolu s polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). Umožňuje řídit replikaci jakékoli konkrétní sekvence DNA vybrané experimentátorem.

Mezi technikami rekombinantní DNA existují dva zásadní rozdíly. Jedním z nich je, že molekulární klonování zahrnuje replikaci v živé buňce a PCR zahrnuje in vitro. Dalším rozdílem je, že první metoda umožňuje řezání a vkládání sekvencí DNA a druhá je zesílena kopírováním existující fronty.

Vektor DNA

Získání rekombinantní DNA vyžaduje klonovací vektor. Pochází z plazmidů nebo virů a představuje relativně malý segment. Výběr vektoru pro molekulární klonování závisí na výběru hostitelského organismu, velikosti klonovatelné DNA a na tom, zda by měly být exprimovány cizí molekuly. Segmenty lze kombinovat pomocí různých technik, jako je klonování restrikční / ligázové nebo Gibsonovy sestavy.

Klonování

Ve standardních protokolech zahrnuje klonování sedm kroků.

1. Výběr hostitelského organismu a klonovacího vektoru.
2. Získání dna vektoru.
3. Tvorba klonovatelné DNA.
4. Vytvoření rekombinantní DNA.
5. Jeho zavedení do hostitelského těla.
6. Výběr organismů, které jej obsahují.
7. Výběr klonů s požadovanými inzercemi DNA a biologickými vlastnostmi.

Po transplantaci do hostitelského těla mohou být cizí molekuly obsažené v rekombinantním konstruktu exprimovány nebo neexprimovány. Exprese vyžaduje restrukturalizaci genu tak, aby zahrnovala sekvence, které jsou nezbytné pro produkci DNA. Používá jej hostitelský translační stroj.

Jak funguje

Rekombinantní DNA funguje, když hostitelská buňka exprimuje protein z rekombinantních genů. Exprese závisí na prostředí genu sadou signálů, které poskytují pokyny pro jeho transkripci. Patří mezi ně promotor, vazba ribozomu a Terminátor.

Problémy vznikají, pokud gen obsahuje introny nebo signály, které působí jako terminátory pro bakteriálního hostitele. To vede k předčasnému ukončení. Rekombinantní protein může být nesprávně zpracován, složen nebo rozložen. Jeho produkce v eukaryotických systémech se obvykle vyskytuje v kvasinkách a vláknitých houbách. Použití živočišných buněk je obtížné, protože mnoho lidí potřebuje pevný nosný povrch.

Vlastnosti organismů

Organismy obsahující rekombinantní molekuly DNA mají zjevně normální fenotypy. Jejich vzhled, chování a metabolismus se obvykle nemění. Jediným způsobem, jak prokázat přítomnost rekombinantních sekvencí , je prozkoumat samotnou DNA pomocí testu polymerázové řetězové reakce.

V některých případech může mít rekombinantní DNA škodlivé účinky. K tomu může dojít, když je jeho fragment obsahující aktivní promotor umístěn v blízkosti dříve umlčeného genomu hostitelské buňky.

Použití

Technologie rekombinantní DNA je široce používána v biotechnologii, medicíně a výzkumu. Její bílkoviny a další produkty lze nalézt téměř v každé západní lékárně, veterinární klinice, ordinaci lékaře, lékařské nebo biologické laboratoři.

Nejběžnější aplikací je základní výzkum, ve kterém je technologie důležitá pro většinu současných prací v biologických a biomedicínských vědách. Rekombinantní DNA se používá k identifikaci, mapování a sekvencování genů a ke stanovení jejich funkce. Sondy rDNA se používají k analýze genové exprese v jednotlivých buňkách a v tkáních celých organismů. Rekombinantní proteiny se používají jako činidla v laboratorních experimentech. Některé konkrétní příklady jsou uvedeny níže.

Rekombinantní chymosin

Chymosin, který se nachází v sichugu, je enzym, nezbytné pro výroba sýrů. Byl to první geneticky modifikovaný doplněk stravy používaný v průmyslu. Mikrobiologicky produkovaný rekombinantní enzym strukturálně identický s enzymem odvozeným od tele je levnější a vyrábí se ve velkém množství.

Rekombinantní lidský inzulín

Téměř úplně nahradil inzulín odvozený ze živočišných zdrojů (jako jsou prasata a skot) pro léčbu diabetu závislého na inzulínu. Rekombinantní inzulín je syntetizován injekcí genu lidského inzulínu do bakterií rodu etherichium nebo kvasinek.

Růstový hormon

Podává se pacientům, u kterých hypofýza generuje nedostatečné množství hormonu růst pro udržování normálního vývoje. Než byl k dispozici rekombinantní růstový hormon, byl získán z hypofýzy mrtvol. Tato nejistá praxe vedla některé pacienty k rozvoji Creutzfeldt-Jakobovy choroby.

Rekombinantní koagulační faktor

Jedná se o protein srážející krev, který se podává pacientům s formami hemofilie s poruchou srážení krve. Nejsou schopni produkovat faktor VIII v dostatečném množství. Před vývojem rekombinantního faktoru VIII byl protein získán zpracováním velkého množství lidské krve od více dárců. To neslo velmi vysoké riziko přenosu infekčních chorob.

Diagnóza infekce HIV

Každá ze tří široce používaných metod diagnostiky infekce HIV byla vyvinuta pomocí rekombinantní DNA. Test protilátek používá její protein. Určuje přítomnost genetického materiálu HIV pomocí reverzní transkripční polymerázové řetězové reakce. Vývoj testu byl umožněn molekulárním klonováním a sekvenční analýzou genomů HIV.